만성골수성백혈병의 발병,진단, 임상 증세 및 경과
만 성 골 수 성 백 혈 병/김 동 욱/가톨릭대학교 의과대학 혈액 내과 의정부 성모병원
서 론
1845년 베넷과 비루효등에 의해 백혈구수의 증가와 비장이 커지는 질환인 만성골수성백혈병의 증상이 문헌에 처음으로 기술된 이래로 만성골수성백혈병은 여러 가지 암의 진단법과 치료제 개발을 위하여 중요한 질환으로 인식되어 왔다. 만성골수성백혈병은 조혈모세포가 병들어 골수계 혈액 세포들이 병적으로 증식하는 악성 혈액 암으로 백혈병 세포들은 매우 빠른 증식 속도와 함께 예고된 각 혈액 세포의 수명 시계가 고장 나 있기 때문에 정상 조혈 세포들 보다 훨씬 빨리 늘어나게 되며 시간이 흐를수록 점차 전체 골수를 차지하게 된다. 만성골수성백혈병은 염색체-유전자 이상에 의해 인체 암이 발병하는 것이 알려진 최초의 암이며, 최근에 소개된 표적항암요법 (글리벡)의 놀라운 치료 효과, 그리고 치료 후에도 아주 적은 양으로 남아있는 백혈병 세포들이 그 양에 따라 후에 어떠한 경과를 나타낼지? 에 대한 정확한 연구 결과 등은 급성백혈병을 포함한 백혈병 모두가 왜 생기는가? 와 같은 이제까지 풀지 못한 의문에 열쇠를 제공할 수 있는 가장 특징적인 혈액 암이다.
만성골수성백혈병 관련 역사
만성골수성백혈병에 관한 중요한 역사적인 발견이나 치료의 변천사는 아래와 같다.
• 1845년 : Bennett에 의하여 만성골수성백혈병으로 생각되는 최초의 환자의 증상이 기술되었다. 환자의 특징은 비장 크기의 증가와 백혈구 중 과립구의 과도한 증가를 보이는 것으로 기술되었다.
• 1960년 : 미국의 필라델피아 시에 있는 펜실베니아 대학교의 연구진에 의해 최초로 필라델피아 염색체 (“ Ph chromosome ”)가 만성골수성백혈병환자에서 발견되는 것으로 밝혀졌다. 즉, 이 연구진 들은 22번 염색체 장완이 짧아지는 염색체 이상이 대부분의 만성골수성백혈병 환자에서 발견됨을 기술하였다.
• 1970년대 초 : 염색체의 구조를 정밀하게 관찰할 수 있는 분염법의 개발로 필라델피아 염색체의 미세 절단 부위의 위치가 밝혀졌다. 즉, t(9;22)(q34q11) 이다.
• 1980년대 : 분자생물학의 발전으로 필라델피아 염색체의 미세 유전자 구조가 밝혀졌다 즉, “ BCR-ABL ” 융합 유전자이다.
• 1990년대초 : BCR-ABL 유전자를 쥐의 조혈모세포에 이입하고 이 조혈모세포를 쥐에게 이식한 후 만성골수성백혈병과 유사한 혈액소견을 보임을 확인하고 BCR-ABL 유전자가 만성골수성백혈병을 일으키는 주요 원인 인자임을 보고하였다.
• 1995년 : 오늘날 만성골수성백혈병의 치료 평가를 위해 널리 사용되는 real time quantitative PCR (실시간 정량적 중합효소연쇄반응법; Q-RT-PCR) 진단법이 최초로 소개되었다.
• 1999년 : BCR-ABL 유전자가 만드는 암 단백효소만을 선택적으로 차단하는 표적 항암제 글리벡의 임상 효과가 최초로 발표되어 BCR-ABL 유전자가 만성골수성백혈병 발병의 결정적인 원인임을 증명하였고 인류가 꿈꾸어 온 가장 이상적인 표적 항암제가 탄생하였다.
발병 원인 ; 만성골수성백혈병은 왜 생기는가?
현재까지 만성골수성백혈병에 대한 수많은 연구에도 불구하고 왜 발병하는지는? 여전히 자세히 알려져 있지 않다. 즉, 백혈병이 발병하는 과정은 시작기, 촉진기, 그리고 진행기의 3 단계로 나누어 생각해 볼 수 있다. 즉, 시작기에는 혈액 세포들의 수명을 연장시키고자 하는 유전자 이상이 발생하게 되는데 이러한 유전자 이상이 왜 생기는지? 는 여전히 알려져 있지 않다. 만성골수성백혈병에서 시작기에 발생하는 가장 전형적인 유전자 이상은 BCR-ABL 유전자 이다. 하지만 BCR-ABL 유전자 또한 왜 생기는지? 는 여전히 정확히 알려져 있지 않다. 촉진기에서는 이미 이상적으로 생긴 BCR-ABL 유전자가 활성화 되는 과정인데 아주 적은 양의 백혈병 세포를 찾아낼 수 있는 PCR법 (“유전자 증폭 검사법”)으로 정상인의 골수 세포를 검사했을 때 성인의 약 25-30%, 1세 미만 영아의 5% 가량에서 BCR-ABL 유전자가 발견된다. 하지만 이들 중 만성골수성백혈병이 발생하는 경우는 거의 없어서 아마도 개인의 면역 상태에 따라서 백혈병으로의 발병이 좌우될 것으로 생각된다. 현재까지의 연구 결과, 만성골수성백혈병이 처음 생길 때 BCR-ABL 유전자 이외에 다른 유전자의 이상이 함께 있었다는 보고는 없다. 즉, 추가 염색체-유전자 이상은 촉진기 보다는 진행기에 볼 수 있는 현상일 것으로 생각된다.
백혈병이 유전성 질환이거나 유전적 소인에 의해 발병한다는 분명한 근거는 여전히 없다. 즉, 만성골수성백혈병이 발병하는데 중요한 BCR-ABL 유전자 이상은 오직 혈액 세포에서만 이상이 발견되며, 환자의 다른 세포들에서는 발견되지 않으며, 일란성쌍동이 중 어느 한쪽이 만성골수성백혈병이 걸렸을 때 다른 건강한 한쪽 쌍동이의 발병 확률은 정상인과 똑같다. 뿐만 아니라 친척 중에 만성골수성백혈병 환자가 있는 경우에 다른 건강한 친척들에서 만성골수성백혈병이 생기는 경우는 그렇지 않은 경우와 별반 차이가 없다.
발생 통계 ; 얼마나 많은 사람들이, 언제 이 병에 걸리나?
만성골수성백혈병은 매년 전체 인구 10 만 명 당 1-2명이 발병하는 것으로 알려져 있어 국내에서는 매년 450-1,000 명의 새로운 환자가 생길 것으로 추정되고 있다. 소아 백혈병 환자 중 만성골수성백혈병 환자는 5% 미만으로 추산되며, 성인 백혈병 환자의 15-20%는 만성골수성백혈병일 것으로 보고되고 있다. 매년 발병 환자 수를 보면 과거 50년 동안 증가하지 않았으며, 남자가 여자에 비하여 만성골수성백혈병이 생길 확률은 1.8배 가량 높다. 평균 발병 연령은 45-55세 사이로 급성 백혈병에 비하여 높기 때문에 만성골수성백혈병이 진정한 성인백혈병이라 말할 수 있다.
발병의 병인 ; 혈액세포 내에 어떤 변화 이 병을 만드는가?
만성골수성백혈병의 발생에 가장 중요한 요인은 염색체-유전자 이상이다. 즉, 9번 염색체와 22번 염색체에 있는 염색체의 일부가 서로 자리를 이동한 새로운 염색체 이상이 생기게 되는데 이것을 필라델피아 염색체 (Ph) 라고 부른다 (만성골수성백혈병에서 발견되는 이 염색체 이상을 1960년에 세계 최초로 발견한 연구소의 위치가 미국 필라델피아 시 였다). 만성골수성백혈병 환자 중 약 90%의 환자는 진단 당시에 필라델피아 염색체를 발견할 수 있으나 (필라델피아 양성; Ph-positive), 나머지 10% 가량의 환자는 필라델피아 염색체를 발견할 수 없다 (필라델피아 음성; Ph-negative). 필라델피아 염색체를 발견할 수 없었던 환자 중 약 절반 정도는 예민한 유전자 증폭 검사법으로 (PCR 검사법) BCR-ABL 유전자를 발견할 수 있다. 이러한 ‘필라델피아 음성-BCR-ABL 양성’ 환자는 전체 만성골수성백혈병 환자의 5% 가량 되며 이들 환자의 증상 등 임상 특징은 필라델피아 양성 환자와 차이가 없다. 나머지 5% 가량의 ‘필라델피아 음성-BCR-ABL 음성’ 인 환자는 진정한 의미의 만성골수성백혈병이라기 보다는 ‘비 전형적인 만성골수성백혈병’ 또는 ‘골수증식성질환’ 이나, ‘골수이형성증후군의 일부’ 일 것으로 생각된다. 필라델피아 염색체는 결국 9번 염색체에 있던 정상적인 C-ABL 유전자의 일부가 22번 염색체에 있는 정상적인 BCR 유전자의 일부와 결합한 것으로 이를 ‘BCR-ABL 암 유전자’ 라고 부른다. 이 새로운 유전자에 의하여 만들어진 단백 효소가 세포질 내의 여러 기질 단백질을 자극하여 전달된 신호가 혈액세포의 핵 속으로 전달되면 혈액 세포의 이상적인 증식이 일어나게 되고, 각종 혈액 세포들의 수명이 비정상적으로 늘어나게 되어 만성골수성백혈병의 특징적인 증상과 인체의 여러 이상을 초래하게 된다.
만성골수성백혈병이 만성기에서 가속기 및 급성기로 진행하는 과정에서는 필라델피아 염색체 이외의 다른 염색체-유전자 이상이 동반되는 경우가 많은데, 주로 이중 필라델피아 염색체, 3, 7, 8, 17, 19, 21번 염색체 이상이 가장 많이 발견된다. 이러한 추가적인 염색체 이상은 진행된 환자의 약 50-80% 가량에서 볼 수 있다. 또한 17번 염색체에 존재하는 p53 유전자 이상은 급성기 중 골수구성 급성기와 관계가 있고 만성기에서는 발견되지 않는 반면 RB1 유전자 이상은 림프구성 급성기에서 흔히 관찰 된다.
증상과 증세 ; 병이 생기면 어떤 증상이 오는가?
일차적으로 확인할 수 있는 특징적인 증상과 검사실 소견은 아래의 표와 같다.
- 일차적인 증상 -
• 피로감, 쇠약감, 체중 감소
• 비장 크기 증가
• 백혈구 증가, 혈소판 증가
- 검사실 소견 -
: “혈액 도감; hematologic atlas”
• Leukocyte Alkaline Phosphatase 감소 (Chronic Neutrophilic Leukemia는 예외)
• LDH, uric acid, V-B12/transcobalamin : 증가
만성골수성백혈병은 만성기, 가속기, 급성기의 3 단계를 거쳐 진행하게 되는데 만성골수성백혈병 환자의 85% 가량이 만성기에서 진단되며 이중 80%는 가속기를 거쳐 급성기로 20%는 가속기를 거치지 않고 곧바로 급성기로 진행한다. 최근 들어 정기적인 신체검사의 영향으로 과거에 비해 발병 초기에 진단되는 경우가 많기 때문에 약 40-50% 정도의 환자는 발견 당시에 특별한 증상이 없다. 하지만 이들 만성기 환자들 중에는 발병한 것을 모르고 1-2년 이상이 지난 후에나 뒤늦게 발견되는 경우도 흔한데, 이러한 경우에는 비장이 커지거나 (비장종대), 혈액 검사상 호염구 수가 증가하고, 체중 감소가 동반되는 경우가 많다. 진단 시에 가장 흔한 증상들은 빈혈과 비장종대에 의한 피로감 과 왼쪽 상복부 부위의 통증이나 덩어리 촉지이다. 만성골수성백혈병은 과 대사성 질환으로 이로 인한 잠자리에서의 식은땀, 발열, 식욕부진, 체중 감소, 그리고 통풍 등이 동반될 수 있으나 흔하지는 않다. 발견될 당시에 백혈구 수의 증가와 혈액의 끈적거림 (점도)이 증가하기 때문에 생길 수 있는 증상으로 남성 성기의 발기, 귀 울림, 멍한 정신 상태, 망막 출혈, 그리고 뇌 경색이나 뇌 출혈이 드물지만 함께 올 수 있다. 진찰 시에 비장 크기의 증가는 40-60% 까지의 환자에서 발견되고, 약 10-20% 가량의 환자는 간이 커지게 된다. 비장과 간의 크기가 커지는 것은 만성골수성백혈병 환자의 혈액 내에 늘어난 각종 혈액세포를 신속히 제거하기 위하여 혈액 세포의 무덤 역할을 하는 비장과 간이 많이 일하게 되어 이차적으로 커지는 것으로 치료에 의해 혈액세포의 수가 정상적으로 되돌아 오면 비장과 간은 더 이상 만져지지 않는다. 만성골수성백혈병에서 림프절이 커지거나 골수 이외의 다른 장소에 (즉, 피부 밑, 뇌, 안구 뒤 등) 백혈병 세포가 침범하는 것은 흔하지 않지만 만일 이러한 장소에서도 발견되는 경우에는 진행된 경우로서 치료에 잘 반응하지 않는다. 가속기로 진행하면서 피로감의 증가, 관절이나 뼈의 통증, 체중감소, 비장의 크기 증가 등의 만성기 때 적절한 치료로 쉽게 좋아졌던 증상들이 다시 생기게 되고 전에는 잘 듣던 치료법들이 점차 효과가 없어지게 된다. 급성기로 진행되면서 거의 모든 환자는 체중의 감소, 발열, 출혈, 반복되는 폐렴 등의 감염증상이 흔히 생기게 되며 증가된 백혈병 세포는 림프절, 피부 밑, 뼈, 그리고 뇌신경계 (림프구성 급성기 환자의 30%) 등을 흔히 침범하게 된다.
<가속기의 기준>
1. 다 변량 분석에 의한 기준
1) 말초혈액 백혈병 아구 > 15%
2) 말초혈액 백혈병 아구 + 전 골수구 수 > 30%
3) 말초혈액 백혈병 호염구 > 20%
4) 혈소판 수 < 10 만 이하 (x 106/L; 치료하지 않은 상태에서)
5) 추가 염색체 이상 (최근에는 제외하는 경우가 많다)
2. 임상에서 흔히 사용되어 온 기준
1) 골수 또는 말초혈액 백혈병 아구 > 10%
2) 골수 또는 말초혈액 호염구 + 호산구 > 20%
3) Peger-Huet 유사 과립구, 유핵 적혈구 , 또는 거핵구 유핵 물질의 흔한 출현
4) 골수의 레티큘린 또는 콜라겐 섬유화의 증가
5) 치료에도 불구하고 백혈구 수 증가 (> 5만), 빈혈 (헤마토크릿 < 25%), 혈소판 감소 (< 10만)
6) 현저한 혈소판 수 증가 (>100만)
7) 치료에도 불구하고 비장 크기의 증가 (>10cm)
8) 원인 불명의 발열 또는 뼈의 통증
9) 치료제 용량의 증가
<급성기의 기준>
1) 골수 또는 말초혈액 백혈병 아구 > 30%
2) 골수 및 혈액 이외의 장소에 백혈병 세포 침윤
임상 경과 ; 만성골수성백혈병의 진행은 어떤가?
만성골수성백혈병은 초기에는 대부분의 환자가 만성기로 시작하지만 시간이 지날수록 치료에도 불구하고 가속기, 급성기로 진행하여 대부분의 환자는 사망에 이르게 된다. 1965년부터 2002년까지 조사된 미국 MD 앤더슨 암 센터의 자료에 의하면 환자의 50%가 생존할 수 있는 기간은 만성기 71 개월, 가속기 환자는 28개월, 급성기는 5 개월 이었으며, 글리벡을 사용한 환자의 3년 생존 기간은 95% 였다. 또한 평균 만성기 유지기간은 6-7년 이었으며, 가속기 유지기간은 9-24 개월, 급성기 유지기간은 3-6 개월 이었다. 즉, 동종조혈모세포이식을 시행하지 않은 경우에는 대부분의 환자가 결국은 급성기로 진행하여 사망하게 된다. 또한 만성골수성백혈병은 발병 후 시간이 경과할수록 백혈병 세포는 증가하지만 정상 조혈모세포의 수는 점진적으로 감소하게 되어 급성기의 말기에 이르면 정상적인 조혈모세포를 거의 찾아 볼 수 없다. 또한 병이 진행할수록 그리고 성숙세포로 분화할수록 Ph 양성 암세포가 차지하는 비율은 점진적으로 증가한다.
혈액 및 골수 조직 병리 검사 ; 혈액 및 골수에 어떤 변화가 오는가?
만성골수성백혈병을 의심하고 병의 진행 정도를 구별하는데 말초혈액 검사와 골수 검사는 필수적이다. 급성백혈병과는 달리 만성골수성백혈병에서는 말초혈액 검사 결과가 골수 검사 결과와 같은 비중으로 중요하게 고려 된다. 만성기에 가장 흔한 말초혈액 검사 소견은 현저한 백혈구 증가이다. 약 50-70%의 환자는 백혈구 수 (정상 : 4천-1만 x 106/L)가 10만 이상으로 증가되어 있으며 약 10-20%의 환자는 치료 없이도 백혈구 수가 심하게 변화할 수 있다. 혈소판 수 (정상 : 15만-45만 x 106/L)의 증가 또한 만성골수성백혈병 환자에서는 흔히 관찰할 수 있는데 약 30-50% 정도의 환자는 만성기로 진단될 당시에 이미 100만 이상으로 늘어나 있다. 혈색소가 10 g/dL 이하로 감소하는 빈혈은 약 20% 가량의 환자에서 있으며 진단되기 전의 이유 없는 장기간의 피로감은 빈혈에 의한 경우가 많다. 만성기로 진단되는 초기에 볼 수 있는 혈액 검사상의 특징 중의 하나는 성숙된 모든 골수계 세포를 관찰할 수 있는데 이를 ‘hematology atlas; 혈액학 도감’ 이라고도 표현할 정도이다. LAP (leukocyte alkaline phosphatase) 수치는 일반적으로 매우 낮아져 있어서 다른 ‘골수 증식성 질환’이나 ‘이차성 백혈병 유사 현상들’ 과 구별하는데 참고가 될 수 있다. 골수 조직 검사에 의한 골수 내 세포들의 분포는 과 충실도를 보이며 골수계와 적혈구계 세포들의 비율은 10:1에서 30:1 까지로 매우 증가되어 있다. 또한 골수에 섬유화 변화가 관찰되는 경우가 흔하며 심하게 섬유화 변화가 있는 경우에는 나쁜 예후를 보이는 경우가 많다. 가속기와 급성기로 진행하는 경우에는 더욱 뚜렷한 변화가 말초혈액과 골수 검사에서 나타나게 된다. 가속기의 정확한 진단은 매우 중요하지만 여전히 병원에 따라 약간의 차이를 보이고 있고, 최근에 글리벡이 치료제로 널리 쓰이고 난 이후에는 몇 가지 가속기 기준은 치료후의 예후를 잘 반영하지 못할 수 있다 (특히, 일부 추가 염색체 이상만으로 가속기로 진단된 경우에는 글리벡 투여 후에 치료 성적이 만성기 환자와 비슷하다). 급성기 진행은 약 50%의 환자는 골수구성으로, 25%의 환자는 림프구성으로 진행하며, 나머지 25%의 환자는 골수구성인지?, 림프구성인지? 구별할 수 없거나 다른 매우 드문 형태의 급성기 현상 (혈소판 전구세포계, 적혈구계, 전골수구계, 호염구계 등)을 보인다. 림프구성 급성기 백혈병 세포에서 골수구계의 세포 표면 항원의 발현은 흔한 현상으로 알려져 있다.
예후 인자 ; 치료에 대한 반응의 좋고, 나쁨을 미리 알 수 있을까?
만성골수성백혈병 환자의 치료에 대한 반응과 병이 나빠지는 속도는 환자에 따라 매우 다양하다. 그렇다면 과연 어떤 치료를 시작하기 전에 미리 잘 반응할 것인지? 를 사전에 알아볼 수 있는 방법은 없을까? 우선 처음부터 백혈구 수의 현저한 증가, 혈소판 수가 현저히 증가하거나 감소한 경우, 백혈병 세포 (아구)의 증가, 호염구 수의 증가, 비장이 크게 만져지는 경우, 그리고 고 연령인 환자에서는 병의 진행이 빠르고 치료에 대한 반응이 좋지 않다. 즉, 이러한 여러 예후 인자들을 복합적으로 고려하여 앞으로의 치료에 대한 반응성을 개별 환자에서 미리 알아 볼 수 있으며, 전부터 사용하여 왔던 치료법과 글리벡 등 새로운 치료법의 효과를 서로 비교해 볼 수도 있다. 그렇다면 어떠한 기준들을 이용하여 환자의 진단 시에 처음 시작하려고 하는 치료의 결과를 미리 예측해 볼 수 있는가? 아래에 제시한 것과 같이 오랜 기간 동안 연구되어 온 2가지의 기준 (Sokal score & Hasford score 또는 Euro score)이 가장 흔히 사용되고 있다. 하지만 Sokal 지수는 중간 위험군과 고 위험군 환자의 생존 기간을 구별할 수 없는 단점을 가지고 있다. 즉, Sokal 기준으로 중간 위험군과 고 위험군 사이에는 2.5년이 지난 시점에 비로서 생존율에 차이가 나타났으며, 6.25년이 지난 시점부터는 생존율이 비슷해 지기 때문에 이 지수가 정확하게 치료에 대한 반응을 예측하지는 못하며 중앙 생존 기간이 불과 1년 밖에 차이가 나지 않았다 (Hasford 등, JNCI, 1998 90:11;850-858). 이러한 기존의 예후 예측 방법의 문제를 해결하기 위해 새로운 지수의 개발에 대한 연구가 시작되었는데 1998년에 유럽 만성골수성백혈병 연구 그룹이 12 개 병원에서 인터페론으로 치료 받은 1,500 명 이상의 만성골수성백혈병 환자의 자료를 수집, 분석하여 새로운 예후 예측 지수 (Euro score 또는 Hasford score 로 명명)를 제안하였다.
Euro score = [(0.6666 × 환자 나이 : 50세 미만-0, 50세 이상-1) + (0.0420 × 비장크기 : 갈비뼈 밑부터 cm) + (0.0584 × 백혈병 아구 %) + ( 0.0413 × 호산구 %) + (0.2039 × 호염구 : 3% 미만-0, 3% 이상-1) + (1.0956 × 혈소판 수 : 150만 미만-0, 그 이상일 때-1)] × 1000
즉, 진단 되었을 때의 환자의 나이, 비장의 크기, 백혈병 아구 %, 호산구 %, 호염구 %, 그리고 혈소판 수를 중요한 변수로 일정한 가중치를 부여하여 분석한 결과, 종전에 사용해 오던 Sokal 지수보다 치료에 대한 반응과 예후를 훨씬 잘 반영하는 것으로 나타났다. 하지만 이러한 지수들은 인터페론으로의 치료 결과를 잘 반영하는 반면에 글리벡으로의 치료 결과나 조혈모세포이식 후의 치료 결과는 반영하지 못하는 것으로 알려져 있다.
표. Euro score에 의한 환자 비율 및 생존 기간 (JNCI, J Hasford et. al., 1998)
지수 합 비율 생존 기간 중앙치 5년 생존율
저 위험군 0-780 41.4% 96 개월 75 %
중간 위험군 781-1480 44.5% 65 개월 56 %
고 위험군 1481 이상 14.1% 42 개월 28 %
이외에도 필라델피아 염색체 이외의 특정 추가 염색체 이상이 인터페론이나 글리벡 투여에 대한 반응이 좋지 않으며, BCR-ABL 유전자 이상 이외에 여러 가지 추가적인 유전자 이상들이 (large deletion of chromosome 9, DNA methylation of the Pa promoter of C-ABL, Telomere shortening in chronic phase, down-regulation of IRF-4) 만성골수성백혈병이 빨리 진행하도록 하거나, 치료에 잘 듣지 않도록 하는 것으로 알려져 있다.
진 단 ; 만성골수성백혈병을 어떻게 진단 할 수 있는가?
환자가 전신 피로감 또는 복부에서 덩어리가 만져지는 것과 같은 증상을 느끼거나 우연히 신체 검사에서 혈구 수 증가의 이상 소견이 발견되는 경우에 환자의 혈액을 채취하여 자세히 관찰한다. 즉, 혈액 검사에서 혈소판을 포함한 혈구 수의 현저한 증가와 호산구, 호염구, 미성숙 백혈구의 증가는 만성골수성백혈병의 뚜렷한 이상 소견으로 80-90% 이상의 환자는 이러한 혈액 검사의 변화만으로 쉽게 만성골수성백혈병을 의심할 수 있다.
이후 ‘골수 검사’를 시행하게 되는데 골수의 조직병리검사를 통해서 백혈병 아구의 %, 호염구의 %와 골수 섬유화의 심한 정도를 관찰하게 된다. 또한 골수검사를 통해 얻어진 세포를 배양하여 염색체 검사를 함으로써 필라델피아 염색체의 존재 여부를 검사한다. 염색체 검사는 만성골수성백혈병의 진단을 위해 반드시 필요한 검사로서 최소 20개 이상의 세포 분열 중기에 있는 골수 세포를 배양, 분석하여 필라델피아 염색체가 있는지? 를 확인하여야 한다. 염색체 검사는 필라델피아 염색체를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 다른 염색체의 추가 이상이 함께 있는지? 도 관찰할 수 있기 때문에 병의 진행 정도를 평가할 수 있다. 하지만 염색체 검사는 검사의 예민도가 떨어지기 때문에 일부 환자는 필라델피아 염색체의 존재를 확인할 수 없고, 또한 검사 결과를 얻을 때까지 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이러한 단점은 중합효소 연쇄반응 검사법 (PCR) 이나 형광 동소 검사법 (FISH)을 시행함으로써 보완이 될 수 있으며, 이에 더하여 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 검사법 (real-time PCR)을 시행하는 경우에는 예민하게 적은 양의 만성골수성백혈병 세포의 존재를 확인함과 동시에 정확한 백혈병 세포의 양까지도 측정할 수 있다. 이외에 DNA를 이용하여 시행되는 PCR 검사법이나 Southern blot 분석법, BCR-ABL 암 단백질의 존재를 확인하는 항체 분석법 등이 여러 가지 목적을 위해 추가로 사용될 수 있다.
감별 진단 ; 어떤 질병들과 구별하여야만 하는가?
만성골수성백혈병과 비슷한 증상이나 검사 결과를 보여 혼동하기 쉬운 병들을 세밀하게 가려내야만 정확한 치료가 가능하다. 즉, 백혈병양 반응 (leukemoid reaction)이라는 병은 심한 바이러스성 감염이 있을 때 나타날 수 있으며 이러한 경우에 대개는 혈액검사에서 혈소판 수가 5만 이내로 증가되어 있고 toxic granule이 존재하고, vacuolation을 관찰할 수 있다. 또한 과립구 속에 Dohle body, 호염구의 소실, LAP 지수가 정상이거나 증가된다. 또한 피신피질 홀몬제를 복용한 환자에서 과도한 과립구의 증가가 있는 경우에는 만성골수성백혈병과 혼동을 일으키기 쉬우며, 골수이형성증후군의 일부 과 골수증식성질환에서도 혈구 수가 증가하고 비장이 커져 있는 경우에는 만성골수성백혈병과 구별하기 어려울 수 있다. agnogenic myeloid metaplasia의 경우에도 골수 섬유화와는 상관없이 비장이 커져있고, 과립구와 혈소판 수가 증가하기 때문에 구별하기가 쉽지 않다. 또한 일부 철결핍성빈혈이 동반된 진성적혈구 증다증 환자들도 정상적인 혈색소 수치를 보이지만 과립구나 혈소판 수가 증가할 수 있다. 즉, 염색체 검사나 정밀한 PCR 검사법을 이용한 필라델피아 염색체 또는 BCR-ABL 암 유전자의 존재를 확인하는 것이 궁극적으로 이러한 질환들과 만성골수성백혈병을 정확하게 구별하는 가장 효과적인 방법이 될 것이다.
표. 골수 섬유화가 있는 골수계 혈액 암의 감별
질환 비장 종대 백혈구 수 Teardrop 골수 섬유화 골수 내
백혈병 아구 2-3개의 혈구계의 이형성
골수이형성
증후군 0 - + 정상 또는
증감 0 - + + < 30 +
급성거핵구
백혈병 0 - + 정상 또는
증감 0 - + + > 30 +
골수섬유화증
(AMM) + 정상 또는
증감 + + < 30 +
만성골수성백혈병(만성기) + 증가 0 - + 0 - + < 30 0
만성골수성백혈병 (가속기) + 증가 0 - + 0 - + < 30 0 - +
치료 평가를 위한 검사법 ; 치료의 효과를 어떻게 알 수 있나?
조직병리 검사 : 고 배율 현미경을 이용한 검사
염색체 검사 : 필라델피아 염색체 관찰
형광동소 검사 : BCR-ABL 암 유전자 검사 (DNA)
중합효소 연쇄반응 검사 : BCR-ABL 암 유전자 검사 (RNA)
RT-PCR 법 : 정성 검사
Competitive RT-PCR법 : 반 정량 검사
Q-RT-PCR법 : 정량 검사
만일 현재 시행하고 있는 치료법이 효과적이라면 그 치료를 계속 유지할 수 있지만, 그렇지 않은 경우에는 현재의 치료법을 과감하게 포기하고 다른 치료법으로 바꾸던지 아니면 치료제의 강도를 더욱 높여야만 한다. 이러한 이유 때문에, 환자의 치료가 진행되면서 현재 사용하고 있는 치료법이 효과적인지? 를 정기적으로 평가하는 것은 매우 중요하다. 즉, 치료의 효과를 알아보기 위한 검사는 크게 필라델피아 염색체가 남아 있는 정도를 확인하고, BCR-ABL 암 유전자가 얼마나 남아있는지? 를 확인하기 위한 목적으로 시행된다.
<미세잔류백혈병 이란?>
1,000 배율의 현미경 검사법으로 골수나 말초혈액을 검사하였을 때, 확인되지는 않으나 여전히 환자의 체내에 남아있는 적은 수준의 백혈병 세포의 정도를 미세잔류백혈병 (minimal residual disease 또는 leukemia; MRD 또는 MRL) 이라고 부르며 이 수준 이하의 적은 양의 백혈병 세포를 진단하기 위하여는 형광동소검사법 (FISH), 중합효소연쇄반응 검사법 (RT-PCR 또는 Q-RT-PCR) 등의 더욱 정밀한 검사법을 사용하여야만 한다. 즉, 혈액학적 완전관해란 현미경으로 발견되지 않는 적은 양의, 약 100억 개 미만의 백혈병 세포가 남아 있음을 의미한다. 하지만 정밀한 검사를 하였을 때, 환자마다 남아 있는 미세잔류백혈병 세포의 수가 100 억 개 이하에서도 서로 차이가 있어 이를 비교하는 것이 치료의 결과를 평가하고 미래에 어떻게 진행될지? 얼마나 오랜 기간 동안 치료 효과가 유지될지? 를 평가하는데 매우 중요하다. 즉, 최근에 매우 효과적으로 백혈병 세포를 제거하는 것으로 알려져서 활발하게 시행되고 있는 글리벡 치료나 여러 가지 조혈모세포이식 방법들은 많은 환자를 쉽게 미세잔류백혈병 상태로 만들기 때문에 이들 환자에서는 현미경에 의한 병리조직 검사나 염색체 검사 외에도 더욱 정밀한 FISH나 Q-RT-PCR 또는 RT-PCR 검사를 시행하여야만 한다.
그림. 미세잔류백혈병 수와 각종 진단법에 의한 측정 한계
<염색체 검사>
• Ph-positive CML (95%)
– M-bcr positive (98%) : 8.5kb bcr/abl, P210
– M-bcr negative (2%) : minor bcr/abl (p190), micro bcr/abl (p230)
• Ph-negative CML (5%)
– M-bcr positive (50%)
– M-bcr negative (50%)
염색체 검사는 진단과 치료의 평가를 위하여 매우 중요하지만 이 검사는 반드시 골수 검사로만 시행할 수 있다. 만일 어떤 치료가 매우 효과적이어서 적은 양의 만성골수성백혈병 세포가 남아 있는 경우에는 음성으로 나오는 경우가 흔하지만, 인터페론 주사요법을 받는 환자들에서는 염색체 검사는 치료의 결과를 평가하는데 중요한 기준이 되어 왔다. 염색체 검사는 골수에서 혈액세포를 채취하여 직접 검사하거나 세포의 핵 분열을 유도하기 위하여 3-7일 가량 배양을 한 후 염색체가 가장 잘 관찰되는 세포 분열 중기에 있는 세포 속의 염색체를 관찰하게 되는데 최소 20개 이상의 세포를 관찰한 후 필라델피아 염색체 (Ph; 22번 염색체가 짧게 보이는)를 가진 세포의 수를 정상 염색체를 가진 세포의 수로 나누어 백분율로 표현한다.
필라델피아 염색체 % = (Ph 염색체를 가진 세포 수/정상 염색체를 가진 세포 수) x 100
완전 세포유전학적 관해 (complete cytogenetic response; CCR) : 0 %
부분 세포유전학적 관해 (partial cytogenetic response; PCR) : 1-35%
주요 세포유전학적 관해 (major cytogenetic response; MCR) : 0-35%
소수 세포유전학적 관해 (minor cytogenetic response; MinorCR) : 36-65%
최소 세포유전학적 관해 (minimal cytogenetic response; MinCR) : 66-95%
무 반응 (no cytogenetic response; NCR) : 96-100%
치료를 시작한 후 주요 세포유전학적 관해가 얻어진 경우에는 일반적으로 그 치료로 인하여생존 기간 연장의 효과가 있을 것으로 평가한다.
<형광동소검사 ; FISH>
염색체 검사의 낮은 예민도와 결과를 얻는데 걸리는 기간이 길기 때문에 형광동소검사 (FISH)를 병행하여 시행하게 되는데, FISH 검사는 세포 분열의 중기 (metaphase FISH)나 간기 (interphase FISH)에 있는 세포 모두에서 BCR 과 ABL 유전자 탐식자를 이용하여 검사하게 된다. FISH 검사법은 염색체 검사보다도 더 예민하게 BCR-ABL 암 유전자를 확인할 수 있고 세포의 형태까지도 어느 정도 관찰할 수 있는 특징이 있다. 또한 FISH 검사의 결과는 염색체 검사에 비하여 빠른 시간 내에 더 많은 세포를 분석할 수 있는 장점이 있어 많이 활용되고 있지만 아주 적은 양의 만성골수성백혈병 세포만이 남아 있는 경우에는 그 결과 또한 음성으로 나오는 경우가 많아 글리벡이나 조혈모세포이식과 같은 치료에 매우 효과적인 환자에서는 그 결과를 정확하게 평가하는데 어려움이 있다. 일반적으로 형광동소검사도 200-500 개의 세포 중에 BCR 유전자와 ABL 유전자가 융합된 형광을 관찰하게 된다. 정상적으로 1개의 세포에 2개의 BCR 유전자와 2개의 ABL 유전자 형광이 존재하여 총 4개의 유전자 형광이 존재하여야 하지만 만성골수성백혈병과 같이 두 유전자의 융합이 일어나는 경우에는 1개의 BCR-ABL 융합 형광과 각각 1개씩의 정상 BCR과 ABL 유전자의 총 3개의 형광이 1개의 세포에서 관찰된다. 결과에 대한 표현은 역시 백분율로 표시한다.
<중합효소연쇄반응 검사법 ; RT-PCR 또는 Q-RT-PCR>
이 검사법은 치료 결과를 평가하는데 가장 예민한 검사법으로 1 만에서 1 억 개까지의 정상적인 세포 중 1개의 만성골수성백혈병 세포가 섞여 있어도 이를 찾아낼 수 있는 높은 예민도를 가지고 있다. 즉, 최근에 여러 가지 효과적인 치료법들이 사용되면서 예민도가 뛰어난 새로운 검사법은 환자의 치료 결과를 정확하게 평가하는데 필수적인 검사가 되고 있다. PCR 검사는 크게 BCR-ABL 암 유전자의 존재만을 확인하는 정성 검사 (qualitative RT-PCR; RT-PCR) 와 BCR-ABL 암 유전자의 양을 측정할 수 있는 정량 검사 (quantitative real-time RT-PCR 과 competitive RT-PCR) 로 나눌 수 있다.
검사 방법은 BCR-ABL 암 유전자가 만드는 RNA 유전자를 세포로부터 분리하여 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만든 후에 BCR-ABL 암 유전자에 특이한 시발체를 이용하여 암 유전자를 대량으로 증폭시킨 후 (대개는 100만 - 1,000 만 배로) 젤 속에서 전기 영동을 시행하여 암 유전자의 존재를 확인하거나 (RT-PCR), 특수한 형광물질이 부착된 탐식자를 이용하여 함께 증폭함으로써 발광하는 형광 물질을 센서로 감지하여 존재하는 유전자의 양을 정확하게 측정하는 분자생물학적 유전자 분석 방법이다 (Q-RT-PCR). 이러한 방법들은 환자의 세포 속에 있는 암 유전자를 실험실내에서 대량으로 증폭하여 확인함으로써 아주 적은 양의 암세포까지도 예민하게 찾아 낼 수 있는 장점이 있어 모든 백혈병의 진료 영역에 널리 사용되고 있는 최첨단 방법이다.
이 방법을 이용한 현재까지의 연구 결과를 종합해 보면, 조혈모세포 이식 후 6개월과 12개월째 시행한 RT-PCR 검사 결과는 이식 후 재발 가능성을 미리 예측하는데 유용하다. 만일 어떤 환자가 인터페론이나 글리벡 치료 중에 완전세포유전학적 관해 (CCR; 환자들은 이 상태를 ‘제로 클럽; zero club’ 이라고 말하기도 한다)를 얻었고 이때 RT-PCR 검사에서 BCR-ABL 암 유전자도 음성이었다면 이러한 환자는 장기간 병의 진행 없이 생존할 수 있음을 의미한다 (Hochhaus 등, Blood 2000; 95, 62-66) & Kantarjian 등, Cancer 2003; 97, 1033-1041).
정량 검사 중 Q-RT-PCR 검사법 (quantitative real-time RT-PCR; 실시간 정량적 중합효소연쇄반응법) 은 조혈모세포 이식이나 글리벡 치료를 받고 있는 환자에서 정성 검사 보다 더 빠르게 치료에 대한 반응을 예측할 수 있다 (Kim 등, BMT 2003). 즉, 치료 개시 후 3 개월째의 BCR-ABL 암 유전자의 양이 골수 세포에서 0.01 이하인 경우나 말초 혈액 검사에서 0.001 이하인 경우에는 이식 후 재발이 적고, 글리벡에 의해 6개월째에 CCR을 얻을 가능성이 높으며 1년 이후에도 재발 없이 장기 생존할 수 있다.
현재 제시되고 있는 치료 후 평가를 위한 최소한의 표준 검사 일정을 요약해 보면 아래와 같다.
인터페론이나 글리벡으로 치료하는 도중에도 Ph 염색체 이외에 추가로 다른 염색체 이상 (trisomy 8, 5번 과 7번 염색체 이상)이 생길 수 있으나 아직 이러한 염색체 이상이 치료 결과에 대한 장기적인 효과와 어떤 상관 관계가 있는지? 는 잘 모른다. 이러한 이유 때문에 치료 중에 Ph 염색체 이상이 발견되지 않는 경우에도 최소 1년에 한번 정도의 골수 세포를 이용한 염색체 검사는 필요하다.
- 골수 검사는 왜 필요한가? -
의사들이 골수 검사를 처방할 때마다 고민하는 것은 환자들이 골수 검사 때에 받는 고통이다. 특히, 만성골수성백혈병 환자들은 시간이 지날수록 골수 채취가 어렵기 때문에 (급성백혈병과는 달리 만성골수성백혈병에서는 골수 섬유화가 진행되어 채취되는 골수의 양이 적다) 아무리 국소 마취를 잘 하여도 채취하는데 시간이 많이 걸리고 환자들은 힘들어 한다. 최근에 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 검사법 (Q-RT-PCR)이 활발하게 활용되면서 골수 검사 횟수를 줄일 수 있을 것으로 생각되지만 그래도 아래와 같은 이유 때문에 골수 검사는 반드시 필요하다.
1. 만성골수성백혈병에서 필수적인 기본 검사인 필라델피아 염색체 검사 (Ph 염색체)는 골수 세포로만 정확한 결과를 얻을 수 있다.
2. Ph 염색체가 치료에 의해 줄어든 정도에 따라 환자의 생존 기간이 다르다.
3. 혈액 검사로 이상이 없는 환자들 중에도 Ph 염색체 검사를 시행하면 차이가 있을 수 있으며 이러한 현상은 치료를 시작한 후 첫 1년 이내에 흔히 관찰된다.
4. 치료 중 Ph 염색체 이외에 추가 염색체 이상이 치료 중에도 출현할 수 있고 이 이상은 치료에 대한 장기적인 효과를 좌우할 수도 있을 지? 모른다.
5. 인터페론이나 글리벡의 경우, 치료가 진행되면서 내성이 발생하여 염색체 반응이 없어 질 수 있으며 이러한 경우에 투여하는 약제의 종류를 바꾸거나 용량을 증량하여야 한다.
6. 글리벡 치료 후 이식을 시행하고자 할 때, 이식 직전에 남아있는 Ph 염색체 정도에 따라 이식 때 사용하는 항암제의 종류와 강도가 다르다.
7. 처음에 가속기나 급성기로 진단된 환자들에서 이식은 성공율이 떨어져 국내에서는 의료보험이 적용되지 않지만, 글리벡은 가속기나 급성기와 같이 진행된 경우에도 효과가 있기 때문에 이식 전에 만성기나 완전세포유전학적 관해를 만든 후 이식을 보험으로 진행하기 위한 서류를 (좋아진 골수의 조직병리 검사 소견서가 첨부되어야만 함) 다시 만들기 위해서도 필요하다.
위에 제시한 표는 최소한의 골수 검사를 위해 말초혈액으로도 가능한 FISH 검사와 Q-RT-PCR을 최대한 활용한 검사 일정이며 말초혈액세포를 이용한 검사의 단점 (정확도는 골수 세포를 이용한 경우보다 10% 정도 떨어지고, 측정되는 유전자의 양은 10배 가량 적다) 때문에 일부 환자는 치료의 정확한 평가가 어려울 수 있다.
실시간 정량적 중합효소연쇄반응법 (real time quantitative PCR; Q-RT-PCR)
1. 일반 원리
< 개요 및 RQ-PCR의 발전사 >
: 유전자의 정확한 양을 측정하고 이를 실험이나 임상연구에 이용하는 것은 매우 중요하다. 이제까지 알려진 유전자의 양을 측정하는 방법은 southern blot, northern blot, RNase Proection Assay, Eagle Eye program을 이용하여 internal control과 증폭 주기를 조절한semiquantitative PCR, competitive-quantitative PCR(1-2) 등의 방법들이 알려지고 이용되어 왔으나 이러한 방법들은 예민도가 떨어지고, 시간이 오래 걸리며, 오염의 가능성이 높으며, 부정확하다는 많은 단점들을 가지고 있어 이를 실험에 활용하기에는 일정한 한계가 있어 왔다.
RQ-PCR의 경우 1992년 Higuchi등이(3-4) 기존의 PCR방법의 비 정량적인 측정법의 단점을 극복하기 위하여 ethidium bromide를 이용하고 UV를 조사한 후에 발광하는 형광을 측정함으로써 증폭되는 dsDNA의 양을 CCD 카메라를 통하여 측정하는 방법을 개발하였다. 하지만 이러한 방법은 비 특이적인 형광의 발산으로 정확도가 감소하는 단점을 가지고 있었고 이를 보완하기 위한 기술은 발전을 거듭하여 최근에는 유전자의 염기서열에 상보적인 탐식 유전자에 형광 물질을 부착하여 보다 특이적으로 증폭 유전자의 양을 측정하는 방법을 개발하게 되었다(5-6). 이러한 새로운 측정방법의 RQ-PCR은 기존의 다양한 반 정량적 유전자 측정방법의 단점을 극복할 수 있는 방법으로 간편하게 빠른 시간 내에 실시간으로 정확한 양을 측정할 수 있다.
< RQ-PCR의 원리 >
최근에 활발하게 활용되고 있는 RQ-PCR법에서 기본 원리는 PCR증폭에 이용되는 Taq DNA polymerase의 5’ nuclease activity를 이용하는 것으로 증폭 주기 동안에 DNA polymerase에 의하여 upstream primer의 5’ 말단으로부터 합성이 탐식자의 방향으로 일어나며 이후 탐식자의 분해가 일어나게 된다. 이때 이용되는 탐식자(probe)는 5’ 말단에 reporter 그리고 3’ 말단에 quencher dye가 부착된 oligonucleotide로서 quencher dye에 의하여 일정한 범위 내에서 reporter의 형광이 발광하지 않다가 5’ nuclease의 활성에 의한 탐식자의 분해가 일어날 때 분리되며 형광을 발산하게 된다.
RQ-PCR의 정량은 실시간으로 매주기 마다 증폭누적되는 유전자를 측정하여 이를 증폭주기별로 분석하여 표시함으로써 기존의 PCR법이 고정된 주기의 증폭이 완료된 후에 증폭 산물을 분석하던 방법을 탈피하여 매 주기마다 증폭되는 양을 표시 함으로써 정확한 양을 측정할 수 있도록 한다. 특히 중요한 parameter로 CT 값을 들 수 있는데 이는 probe의 분리에 의하여 생기는 형광의 양이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달하는 증폭 주기를 말하며, 정확한 양을 알지 못하는 유전자의 정량은 우선 이 CT 값과 표준 곡선을 통하여 이루어 진다. 이러한 CTs 값의 생산, 표준곡선의 준비, 그리고 초기 유전자의 양이 함께 지원되는 소프트웨어를 이용하여 자동으로 지원된다.
< 초기 와 후기 측정의 효과 >
일반적으로 PCR을 시행할 때 초기에는 비교적 충분한 시료가 존재하기 때문에 급격한 증가 를 보인다. 하지만 주기가 반복될수록 primers, Taq DNA polymerase, nucleotides등이 고갈되고 증폭 곡선은 완만하게 증가하게 되며 이후에는 주기가 반복되더라도 더 이상 유전자의 양은 늘지 않는다.
기존의 PCR 검사법과 RQ-PCR법 사이의 가장 큰 차이라면 증폭된 유전자를 어느 시기에 분석하는가? 이다. 즉, 기존의 PCR 검사법들의 대부분이 일정 주기의 증폭이 모두 끝난 후에 분석함으로써(endpoint detection), 증폭 전의 표적 유전자의 절대 양과는 관계없이 약간의 시료의 차이에 의하여 증폭 량이 크게 차이가 나타날 수 있기 때문에 부정확하다. RQ-PCR의 경우에는 초기에 증폭 산물의 급격한 증가가 있는 시기에 측정함으로써(real time detection), 시료의 고갈에 의한 검체 간의 현저한 증폭 양의 차이에 따른 부정확성을 근본적으로 제거할 수 있다.
< Quantitative competitive PCR 과의 비교 >
PCR 종료 후에 측정하는 정량의 부정확성을 보완하기 위하여 quantitative competitive PCR법이 개발되었으나 이 또한 그 측정 영역의 제한이 있고, 수 차례의 반복적인 희석과 측정에 의해서만 어느 정도 정확한 정량적 측정 조건을 수립할 수 있으며, 표적 유전자가 바뀔 때마다 다른 competitor를 제작하여야 하고, 소수의 표적 유전자 증폭을 위한 공통 primer의 조기 소모가 문제가 되며, 검체의 정량적 측정 전에 표적 유전자와 competitor간의 증폭 효율을 조사하기 위한 validation studies가 있어야만 한다. 또한 PCR후에도 증폭된 표적 유전자와 competitor의 정확한 측정을 위하여 많은 노력이 필요하다.
endpoint 분석법의 여러 가지 단점을 극복하고 정확한 정량을 가능하게 할 목적으로 개발된RQ-PCR의 경우, 실시간으로 CT 값의 측정 및 표준 곡선을 사용한 정량으로 보다 광범위 영역의 측정 범위를 제공할 수 있고, 매 증폭 주기마다 유전자의 양의 측정이 이루어 지기 때문에 유전자 증폭 전 과정을 모니터 하여 정확한 증폭 양상을 관찰 할 수 있으며, 증폭이 끝난 후에 추가적인 과정이 필요 없기 때문에 오염을 최소화할 수 있고, PCR에 필요한 시료가 충분한 증폭의 초기 단계에서 CT 값의 측정이 이루어지기 때문에 primer dimer등의 형성에 의한 시료의 고갈 및 endpoint 분석에서의 시료 고갈 효과로 인한 부정확한 정량을 걱정할 필요가 없다.
2. 개별방법
< Probe의 종류와 원리 >
Real time PCR 은 기존의 PCR과는 달리 형광 signal을 detect하는 것으로 TaqMan 혹은 SYBR Green 형광 물질을 이용하여 실험한다. TaqMan 탐식자는 기존의 PCR과 유사하나 증폭하고자 하는 유전자에 상보적인 형광 물질이 부착된 탐식자를 사용한다는 점이 다르다. TaqMan probe의 5’ end에는 주로 FAM, VIC, TET, HEX등의 dye를 부착하며 보통 ‘Reporter dye’라고 부른다. Probe의 3’ end에는 주로 TAMRA를 부착하는데 이는 ‘Quencher dye’라 부른다. Quencher를 3’ end에 부착하지 않고 Probe sequence내의 thymidine에 부착할 수도 있는데 이때는 PCR과정 동안에 probe의extension을 막기위해 보통 3’ end를 인산화 시킨다. SYBR Green을 이용한 실험에서는 기존의 PCR에 SYBR Green dye를 첨가하여 실시하는데 SYBR Green은 doubled strand DNA에 결합하는 형광물질로서 PCR 과정 중 primer extension 단계에서 DNA에 결합하여 형광 signal을 보이게 된다. SYBR Green을 사용하는 경우에는 TaqMan probe를 사용하는 것보다 특이도가 떨어지고 비 특이적으로 증폭되는 산물에도 결합하여 형광 signal을 보이므로 PCR조건을 특이성이 높게 유지하여야만 한다.
< Primer 제작의 실제 >
PCR primer를 제작할 때는 보통 product의 크기가 200 bp 이하가 되도록 제작하며 Tm이58 ~ 60 °C 사이가 되도록 한다. Probe는 보통20 ~ 30 mer의 길이로 PCR primer 사이에 존재해야 하고 Tm이 PCR primer보다 5 ~ 10 °C 더 높도록 제작한다. 그리고 probe의 5’ end는 G 가 아니라야 하고 G 보다 C base가 더 많도록 제작한다. 또한 probe는 자체적으로 그리고 primer와도 상호 결합하지 않도록 제작 한다.
< CML환자의 real-time PCR에 사용되는 primer와 probe >
- 만성골수성백혈병(CML) 환자의 중요한 mRNA transcripts인 b2a2와 b3a2를 증폭하기 위하여 bcr 유전자의 major break point cluster region(M-BCR) 내 위치하는 exon 13(b2)의 위치에 sense primer : gatgctgaccaactcgtgtg를 abl exon (a3)의 위치에 antisense primer : gcctcagggtctgagtgaag를 제작하고
- e1a2를 증폭하기 위하여 bcr 유전자의 minor break point cluster region(m-BCR) 내 위치하는 exon 1(e1)의 위치에 sense primer : cttccatggagacgcagaag를 이용하고 b2a2와 b3a2를 증폭할 때 사용하는 antisense primer를 공통으로 사용한다.
- c3a2 를 증폭하기 위하여 bcr 유전자의 micro break point cluster region(µ-BCR) 내 위치하는 exon 18(c3)의 위치에 sense primer : cttcgacgtcaaagcccttc와 abl exon (a3)의 위치에 antisense primer : ctaagacccggagcttttcac를 제작하여 실험에 사용한다.
- 증폭된bcr-abl fusion gene을normalization하기 위한 normal abl의 증폭을 위하여 sense primer : gcctcagggtctgagtgaag와 antisense primer : acaccattccccattgtgat를 제작한다.
- bcr/abl probe (5’ agaccctgaggctcaaagtcagatgctact 3’)는 5’end에 FAM을 label하고 probe 내 13 nt에 TAMRA를 incoporation하여 사용하고 abl probe (5’ agagtgttatctccactggccacaaaatca 3’)는 5’end에 FAM을 label하고 17 nt에 TAMRA를 incoporation하여 사용한다 그리고 각 probe의 3’end를 phosporylation시킨다. bcr/abl probe는 abl exon 3의 위치에 있기 때문에 b2a2, b3a2, e1a2 그리고 c3a2에 모두 사용 가능하다.
< 표준 증폭 곡선을 얻기 위한 실험 >
Real-time PCR에서 정량 실험을 할 때는 절대 양을 알고 있는 standard를 10 fold로 serial로 희석 하여 매 실험 시 마다 사용하여야 하는데 보통 표적 유전자를 클로닝하여 plasmid DNA를 얻고 이를 정확하게 정량한 후, 미리 10 fold로 6~7개의 희석 검체를 준비 하여 –70 °C deep freezer에 보관했다가 실험 시마다 꺼내어 사용한다. PCR을 마치고 분석을 할 때 log값으로 계산된 표준 곡선의 기울기가 연속 희석의 정확도와 연관되므로 정확하게 표준 시료를 준비해 두어야 한다.
8 log orders of dynamic range
Ten-fold serial dilutions from 109 to 10 copies of a ß-actin containing plasmid were prepared and amplified in real time using a TaqMan-designed probe. Data analysis was done including 75% of the data points and setting the threshold to 110 RFU. The equation fitting the standard curve is y = -3.22x + 39.95 and r = 0.999. The inset shows the data set plotted on a semilog graph.
3. 검사 프로토콜
: BCR-ABL 유전자 증폭을 위해 본 센터 연구실에서 사용하고 있는 구체적인 프로토콜은 아래와 같다
4. 미세 잔류 백혈병의 평가를 위한 임상 적용
< RQ-PCR의 임상 적용 >
: 미세잔류백혈병의 표적이 되는 질환 관련 유전자를 추적 평가하기 위한 RQ-PCR의 적용에 가장 중요한 점은 표적 유전자의 종류, 이를 검사하기 위한 primer, probe의 염기 서열, 그리고 유전자의 발현 정도에 따라 미세잔류백혈병의 정의가 다를 수 있으며 이를 표준화 시키기 위한 연구는 매우 중요하다.
1) 급성림프구성백혈병
: 급성림프구성백혈병의 대표적인 유전자 이상 중 TEL/AML1, BCR/ABL, MLL aberrations, TCR 및 Ig 유전자 등이 RQ-PCR법으로 미세잔류백혈병을 추적할 수 있는 유전자 이상으로 연구되어 왔으며 드물게 발현하는 유전자 이상의 경우에도 유전자의 전위가 질환의 발병과 밀접하게 연관되어 있는 경우에는 표적 유전자로서 미세잔류백혈병의 정도를 평가하기 위하여 활용할 수 있다 (Table 1).
Table 1. ALL에서 RQ-PCR 검사법을 이용하여 미세잔류백혈병을 평가할 수 있는 표적 유전자들
최근의 Pine 등의 연구에 의하면 (6), IgH, TCR, 그리고 TEL-AML1 유전자의 이상을 SYBR Green I dye를 이용한 RQ-PCR의 표준 검사법과 limiting dilution PCR assay로 상호 비교 검사한 결과 두 방법 사이에 지속적인 재연성이 있으며, RQ-PCR법이 매우 낮은 수준의 미세잔류백혈병을 정량 할 수 있음을 제시하고 있다. Li 등도 (7) 36명의 pre-B ALL 환자 중 34명에서 IgH 유전자의 재배열이 RQ-PCR을 이용한 연구로 미세잔류백혈병의 표적 유전자가 될 수 있음을 제시하고 이들 중 관해유도요법 29일째의 골수 검사에서 미세잔류백혈병의 수준이 0.001 이상인 환자들은 이후에 재발과 밀접하게 연관되어 있음을 보고하고 RQ-PCR법이 치료의 적정성 및 재발을 예측할 수 있는 중요한 검사법임을 보고하고 있다. 이상의 연구 결과로 향후 pre-B ALL 환자 95% 이상이 RQ-PCR을 이용한 미세잔류백혈병의 평가가 가능할 수 있어 이를 응용한 치료법의 고안이나 미세잔류백혈병의 정확한 평가가 가능하다.
초기 진단 시에 환자가 BCR-ABL 유전자 이상을 가진 Ph+ ALL의 경우 CML에서와 같이 이를 RQ-PCR을 위한 표적 유전자로 사용할 수 있으며 본 센터의 Lee 등의 (8) 보고에서와 같이 Ph+ ALL 환자에서 이식 후 GVHD와 GVL의 연관 가능성을 RQ-PCR 검사에 의한 BCR-ABL의 감소 정도로 비교하여 증명함으로써 이러한 예민한 정량적 검사법이 미세잔류백혈병의 병리 현상을 규명하는 데에도 활용될 수 있다. 즉, 기존의 정성적인 PCR 법으로는 간접적인 추측만이 가능했던 미세잔류백혈병의 측정이 RQ-PCR 검사법을 통하여 정확하게 정량화 될 수 있으며 이를 이용하여 재발의 예측 뿐만이 아니고 새로운 치료방법의 고안 및 평가, 백혈병의 병리 현상의 규명 등이 가능하게 되었다.
2) 급성골수성백혈병
: 급성골수성백혈병의 경우에는 이미 다양한 염색체의 전위와 질환의 발병과의 연계성이 연구되어 왔으나 여전히 약 30% 정도의 환자가 PCR로 추적 가능한 AML1/ETO, PML/RARα, 또는 FLT3 유전자의 이상을 가지고 있으며 빈도가 낮은 유전자 전위 이상까지를 포함하는 경우에도 40-50%의 환자만이 미세잔류백혈병의 추적을 위하여 이러한 유전자 이상을 적용할 수 있다 (9, 10). 하지만 최근의 연구에 의하면 AML 환자의 약 25-30%가 기존의 FLT3 유전자 이상 이외의 돌연변이 염기를 가지거나 internal tandem duplication (ITDs)를 가지며 이들중 대부분이 기존의 염색체 검사로 정상적인 소견을 보이는 경우로서 이를 미세잔류백혈병의 진단에 활용할 수 있는 가능성이 높아졌다 (Table 2).
Table 2. AML에서 RQ-PCR 검사법을 이용하여 미세잔류백혈병을 평가할 수 있는 표적 유전자들
일반적으로 RQ-PCR에 의하여 진단 당시에 측정된 유전자의 양은 BCL2 family에 속하는 WT1, BAD, BAX, 그리고 PRAME 유전자를 제외하고는 치료의 결과와는 무관한 것으로 알려져 있으나 (11, 12), 관해 유도 항암요법 후 표적 유전자의 2 log 이하의 감소나 유전자 양이 감소하는 속도의 지연이 치료 후의 재발이나 장기 생존에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (13-15).
3) 만성골수성백혈병
: 가장 활발하게 RQ-PCR이 적용되고 있으며 최근에 새로운 표적 항암제로 널리 연구되고 있는 글리벡을 포함한 조혈모세포 이식 후의 BCR-ABL 유전자의 동태와 질환의 진행 및 치료법의 고안등에 광범위하게 활용되고 있는 백혈병이다. 본 센터를 포함한 다른 기관의 현재까지의 연구 결과, 정성적인 nested RT-PCR의 예민도와 유사한 정도의 10-5~6 정도의 정량적 예민도를 보이며 기존의 염색체 검사, FISH, 그리고 RT-PCR과 일치하는 상관 관계를 보이는 것으로 알려져 있다 (16, 17). 즉, CML 환자에서 RQ-PCR의 적용은 인터페론, 글리벡, 또한 조혈모세포이식 후의 치료 결과를 확인할 수 있고 추가적인 치료의 필요 여부를 판단할 수 있을 뿐만 아니라 미니이식과 표준이식을 선별하여 적용하거나 이식 후에 재발 여부를 조기에 진단하여 조기 면역 요법을 적용하는데 광범위하여 적용되고 있다 (17-21).
4) 기 타
: 이외에도 CLL 환자에서 IgH 유전자나 neuroblastoma 환자에서 tyrosine hydroxylase mRNA의 측정이 RQ-PCR을 통하여 가능하며 치료 후 이들 유전자의 양이 미세잔류질환의 평가를 가능하게 할 수 있는 것으로 알려져 있다.
5. 결론 및 전망
: RQ-PCR은 기존 PCR의 후기 분석에 따른 비정량적 요소를 제거하고 실시간으로 분석함으로써 정확한 정량을 빠른 시간 내에 가능하게 하는 예민하면서도 반복적인 실험에서도 일정한 결과를 도출할 수 있는 획기적인 유전자 정량 분석법으로 자리 잡아가고 있으며 특히 다양한 유전자 이상에 의하여 발병하는 백혈병의 임상 치료에의 응용이 활발하게 이루어 지고 있어 미세잔류백혈병의 연구를 위한 핵심 기법으로 인정되고 있다. 하지만 각 연구실 간의 RQ-PCR법의 표준화, 정확한 미세잔류백혈병의 표준치의 확정, 그리고 미세잔류백혈병 추적을 위한 골수 및 말초 혈액의 검사 주기의 확립은 여전히 해결하여야 할 문제점으로 남아 있어 이에 대한 임상 연구가 더 진행되어야만 하며, 향후 더 나아가 새로운 백혈병 관련 유전자의 규명을 위한 microarray 분석과 같은 추가 연구가 지속되어야 하겠다.
여러가지의 표적 유전자 및 control 유전자를 한 tube 내에서 동시에 측정할 수 있는 기법의 multiplex RQ-PCR 도입과 특정 표적 유전자를 위한 미리 형광을 부착하여 제조된 probes들을 표준화하여 실험 과정을 단순화 하는 방법들이 개발될 전망이다.
Real time PCR은 기존 PCR의 후기 분석에 따른 비정량적 요소를 제거하고 실시간으로 분석함으로써 정확한 정량을 빠른 시간 내에 가능하게 하는 예민하면서도 반복적인 실험에서도 일정한 결과를 도출할 수 있는 획기적인 유전자 정량 분석법으로 자리 잡아가고 있다. 최근 이를 이용한 많은 연구들이 유전자 발현의 연구의 핵심 기법으로 인정되어 국내에서도 이에 대한 표준화 연구 및 임상적용이 활발히 일어나기를 기대한다.